Более ранняя, по преданию, была воздвигнута на этом же месте в 1377 году Василием Долом в память о жене и дочери, носивших имя Анастасия.
Нынешняя каменная церковь выстроена в 1539 году после большого пожара в Пскове.
Это крупный памятник псковского зодчества, большая приходская церковь. Она полностью, всеми своими объемами установлена на мощный сводчатый подклетный этаж и ее можно рассматривать как двухъярусную. Церковь одноглавая, трехапсидная, с уравновешенными элементами здания. В XVII веке были перестроены приделы, расширены окна храма, внутри главное помещение оформлено в XIX веке обработкой в духе классицизма. Ступенчатые своды церкви опираются на четыре скругленных столба.
Крыша имеет четырехскатную форму, придел и галерея плоские, апсиды – гиперболическое покрытие. В начале XIX века была поставлена внушительная, стройная двухъярусная колокольня с высоким граненым шпилем и массивными входами на паперть. Несмотря на все переделки, можно заметить прекрасные пропорции здания и совершенство былого интерьера. В 16 веке это была одна из красивейших церквей Пскова.
Церковь Анастасии Римлянки находится под охраной как памятник республиканского значения. В настоящее время храм передан епархии.