Роль городского собора, - самое старое из сохранившихся в Мышкине каменных зданий. Она построена в 1766 г. На средства местного уроженца, петербургского купца А.П.Березина и основательно перестроена в 1830-е годы.
В 1820-1830-е гг. проведена реконструкция, в ходе которой были пристроены портики и возведен купол. В 1843-1865 гг. каменщиком Порфирием Ермолаевичем Лузиным была возведена колокольня. разобранная в 1930-х гг. Иконостас выполнен в 1777 г. дворовыми людьми помещиков Кожиных, в 1827 г. отреставрирован Захаром Григорьевым и дворовым художником помещика Перова. Храм расписан в 1843 г. ростовским художником Евгением Александровичем Строгановым. Особо почиталась чудотворная икона Богоматери, именуемая "Троеручица".
У подножия холма, на котором поставлена Никольская церковь, прежде находилась шатровая часовня, выстроенная местными купцами в 1888 году (Такие часовни строились тогда по всей России в память «о чудесном спасении императора Александра III во время железнодорожной катастрофы в Борках). После революции на месте часовни поставили памятник В.И.Ленину.
В подвалах собора открыта экспозиция "Тайны 18 века". До 2004г. в соборе располагались Дом культуры и кинотеатр.